熒光PCR的探針法分為全基因組核酸探針、克隆探針、寡核苷酸探針、單鏈RNA探針、cDNA探針、蛋白質(zhì)探針以及酶探針。帶大家一起了解下寡核苷酸探針、cDNA探針、RNA探針的特點(diǎn)。寡核苷酸探針特異性較高,區(qū)別染色體上一個(gè)堿基的突變;由于其鏈短,分子量小,雜交時(shí)間較短(僅需1-2小時(shí)),可預(yù)測(cè)雜交條件,可直接利用DNA序列人工合成獲得特異片段而無需分子克隆,獲得探針相對(duì)容易。但是由于其鏈短致使標(biāo)記率較低,也影響了檢測(cè)的敏感性,僅能檢出含很少的標(biāo)本。cDNA探針以RNA為模板,用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA探針。主要用來分離cDNA文庫(kù)中相應(yīng)的基因。RNA探針一般是單鏈,具有單鏈DNA探針的優(yōu)點(diǎn),又具有RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反應(yīng)中RNA探針比相同活性的DNA探針?biāo)a(chǎn)生信號(hào)要強(qiáng)。熒光定量PCR類產(chǎn)品的組成方式通常為:1管反應(yīng)緩沖液+1管酶的形式。其中反應(yīng)緩沖液包含熒光PCR反應(yīng)緩沖系統(tǒng)、引物、探針、dNTP;酶包含Taq酶、UNG酶。這種形式的產(chǎn)品使用方法復(fù)雜,必須先將反應(yīng)緩沖液和酶按照比例混合均勻后,分裝至PCR擴(kuò)增管中,然后再加入樣本。由于酶的用量通常較少(≤0.5μL)、酶液較粘稠,且配制過程繁瑣,配制誤差較大、反應(yīng)重復(fù)性不好。熒光PCR凍干的試劑凍干機(jī)Pilot5-8T技術(shù)要點(diǎn):
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